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氨基表面修飾磁性納米粒子(MNP-NH2)對黃酮類和有機酸類成分選擇吸附研究
[發布日期:2019-01-03  點擊次數:1021]

隨著納米科學的迅速發展,各種各樣的磁性納米材料被成功地合成出來,并開始應用于磁性存儲介質、生物傳感器、藥物轉運載體和污水處理等領域。Fe3O4納米粒子由于結構相對簡單、成本低、毒性低、比表面積較高以及吸附性能良好得到廣泛應用。為了改善Fe3O4磁性納米粒子材料的選擇吸附性能,提高捕獲中草藥及食品靶點的能力,諸多功能基團如巰基(-SH)、氨基(-NH2)、羧基(-COOH)、磺酸基(-SO3H)、羥基(-OH)等被用于提取材料的改性。在樣品預處理中,相比較傳統固相萃取(SPE),磁性固相萃取(MSPE)中將磁性(Fe3O4)納米粒子作為吸附劑,已經吸引了相當多的關注。張卓琦等制備了磁性介孔納米粒子并負載了抗癌藥紫杉醇,提高了其對人宮頸癌HeLa細胞的抑制率。Wu等制備了氧化石墨烯復合磁性納米材料從茶、葡萄酒和尿液樣本中提取黃酮類成分。雖然,磁性納米粒子的獨特特征已經引起的生物醫學科學領域的廣泛關注,但將其應用于食品和中藥中化合物提取研究仍較少。

本研究構建了MNP-NH2磁性納米材料,探索其對黃酮類及有機酸類化合物的吸附規律,并將MNP-NH2作為提取劑,首次應用到金銀花藥材中提取黃酮類及有機酸類成分,開發了其從植物來源的中藥、食品中提取單體化合物的潛力。為MNP-NH2應用于中草藥、天然藥物及食物中黃酮類及有機酸類成分的提取提供依據。

1  材料

1.1  原料及試劑

對照品木犀草素(批號20160709)、木犀草苷(批號20160709)、花旗松素(批號20161211)、二氫楊梅素(批號20160705)、蘆丁(批號20160709)、柚皮素(批號20160607)、綠原酸(批號20161210)、咖啡酸(批號20160610)、水楊酸(批號20161210)、莽草酸(批號20160721)、原兒茶酸(批號20160911)、沒食子酸(批號20160908)購自南京澤朗醫藥公司(經HPLC測定,質量分數≥98%)。金銀花藥材產于山東,經天津中醫藥大學李天祥教授鑒定為忍冬科植物忍冬Lonicera japonica Thunb. 的干燥花蕾或帶初開的花。

FeCl3•6H2O、1,6-己二胺、無水乙酸鈉(NaAc)購于阿拉丁試劑公司;乙二醇、無水乙醇購于天津科密歐試劑有限公司;磷酸購于天津市福晨化學試劑廠;磷酸鈉,氫氧化鈉購于天津市化學試劑批發公司;色譜甲酸、乙腈購自美國Sigma公司;所用水為屈臣氏蒸餾水。

1.2  儀器

Sartorius BT125D十萬分之一天平,賽多利斯科學儀器有限公司;JA31002電子天平,上海精天電子儀器有限公司;TG16-WS臺式高速離心機,長沙湘儀離心機儀器有限公司;KH3200B超聲波清洗器,昆山禾創超聲儀器有限公司;DHG-9030A電熱鼓風干燥箱,北京博達科技公司;DZF-6020MBE真空干燥箱,杭州科曉化工儀器公司;DF-101S型集熱式磁力攪拌器,鞏義市予華儀器公司;DELTA 320 pH計,瑞士Mettler Toledo公司;Waters2695高效液相色譜儀,美國Waters公司;PPMS-9振動樣品磁強計,美國量子設計公司。JEOL JSM 6700F型掃描電子顯微鏡(SEM),日本Jeol公司;Hitachi H-800型透射電子顯微鏡(TEM),日本Hitachi公司;Bruker 550型傅里葉變換紅外光譜(FT-IR)儀,德國Bruker公司。

2  方法與結果

2.1  MNP-NH2磁性納米粒子制備

采用經典的溶劑熱合成法制備MNP-NH2,稱取FeCl3•6H2O(1.5 g)和1,6-己二胺(4.0 g)置于圓底燒瓶中,加入50 mL乙二醇,充分攪拌、超聲,使塊狀的固體溶解,加入NaAc(4.5 g)繼續劇烈攪拌30 min,使之形成均一的黏稠液體,溶液顏色由淺黃色逐漸變為深棕色;將混合溶液轉移到50 mL的反應釜中,密封后放入烘箱,在200 ℃下反應10 h;冷卻至室溫后用釹鐵硼磁鐵分離出黑色固體MNP-NH2,依次分別用去離子水和無水乙醇各超聲洗滌3次,60 ℃條件下真空干燥8 h,制得MNP-NH2

2.2  MNP-NH2的表征測試

2.2.1  電鏡分析  采用SEM測定MNP-NH2納米粒子的形貌特征,真空度大于1.33×10−6Pa,加速電壓3.0 kV,放大倍數80 000。通過TEM分析MNP-NH2的特征,觀察樣品的精細結構。加速電壓200.0 kV,放大倍數200 000,真空度大于10−6Torr(1 Torr約為133.3 Pa),拍攝MNP-NH2的粒子形貌。

由溶劑熱合成法制得的MNP-NH2主要為球狀結構,磁性納米粒子表面被氨基修飾可以保護Fe3O4被氧化,最后制得形貌規則、結構穩定、分布均勻的MNP-NH2復合材料。由圖1、2測試圖譜可知,MNP-NH2納米粒子粒徑大小約20 nm,分布較為均勻,基本為單層,似球形,局部有顆粒聚集和疊加。

2.2.2  FT-IR分析 采用KBr壓片,波數范圍400~4 000 cm−1,分辨率4 cm−1,掃描次數32次。測定MNP-NH2納米粒子結構中化學官能團的結構特征。MNP-NH2的紅外光譜圖見圖3,在586 cm−1處為Fe-O-Fe鍵的特征吸收峰;1 650 cm−1處的吸收峰是由O-H的彎曲振動產生的,說明Fe3O4MNP-NH2表面存在一些-OH基團。3 379、1 261 cm−1的特征吸收對應氨基的N-H強伸縮振動吸收和C-N伸縮振動吸收,說明反應后磁性粒子表面生成了氨基功能基團。

2.2.3  磁性測試分析(VSM) 振動樣品磁強計適用于各種磁性材料的測量。本實驗采用美國量子設計公司的超導量子干涉器件測定MNP-NH2納米粒子的磁滯回線。從圖4中可以明顯看出,在無外加磁場情況下,制備的MNP-NH2能均勻的分散在溶液中,當有外加磁場時(即磁鐵靠近時),MNP-NH2能迅速向磁場方向聚集,均一的分散液迅速出現分層現象;Fe3O4MNP-NH2的飽和磁化強度(M)分別為92.26、76.35 emu/g,MNP-NH2M降低,是由于MNP-NH2表層被修飾了一定量的-NH2,影響了M,從而降低了MNP-NH2的磁矩。當外加磁場強度(H)降為零時,磁性樣品的矯頑力和剩磁都幾乎為零,且幾乎觀察不到磁滯現象,因此這種磁性納米粒子非常適合用做載體。

2.3  MNP-NH2對中藥單體成分吸附性考察

2.3.1  色譜條件 色譜柱為WatersSymmetry C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動相及等度洗脫比例的確定依據《中國藥典》2015年版相關化合物檢測條件并適當調整,結果見表1;體積流量1 mL/min;進樣量10 μL;溫度30 ℃。

2.3.2 對照品溶液的配制  取木犀草素、木犀草苷、花旗松素、二氫楊梅素、蘆丁、柚皮素、綠原酸、咖啡酸、水楊酸、莽草酸、原兒茶酸、沒食子酸對照品適量,精密稱定,置10 mL棕色量瓶中,加甲醇定容,4 ℃保存即得對照品儲備液。

2.3.3  樣品溶液吸附  分別取12種中藥單體成分樣品溶液各5mL,每份加入1 mg磁性納米粒子,混合均勻后在室溫下超聲40 min,借助外加磁鐵實現磁性納米粒子與樣品液的分離(固液分相),吸取上清液,以微孔有機濾膜濾過,分別測定吸附前樣品液、吸附后上清液中指標成分的質量濃度。

2.3.4  線性關系考察  精密稱取各對照品儲備液適量,按倍數用甲醇逐級稀釋,配制成一系列對照品溶液,按“2.3.1”項色譜條件進樣,以峰面積為縱坐標(Y),各對照品質量濃度為橫坐標(X),得回歸方程見表1,r均在0.999以上,在線性范圍內線性關系良好。

2.3.5  吸附過程 以MNP-NH2作為吸附載體,將12種中藥單體成分儲備液分成實驗組和空白組,在實驗組中加入一定量的磁性納米粒子,未加入磁性納米粒子的原料液(或者標準溶液)作為空白組,超聲處理。實驗組在外加磁場作用下實現磁性納米粒子與原料液的分離(固液分相),取上清液過膜,空白組直接過膜,進樣分析,得到吸附前后的液相色譜圖,按公式計算出飽和吸附量(Q)。磁性納米粒子Q的計算公式為Q[(C0C1)V1]/M,其中C0是起始質量濃度(mg/mL),C1是吸附平衡后的質量濃度(mg/mL),V1是加入各單體成分溶液的體積(mL),MMNP-NH2磁性納米粒子的質量(g)。

2.3.6  MNP-NH2對中藥單體成分吸附效果  研究主要考察了氨基鐵納米粒子對不同中藥單體成分的吸附情況。稱取相同質量的氨基鐵納米粒子與相同濃度的12種中藥單體成分在相同條件下進行分離提取,氨基鐵納米粒子對12種中藥單體成分吸附結果見圖5。MNP-NH2對中藥單體的吸附考察中,吸附率由大到小依次為木犀草素>蘆丁>木犀草苷>二氫楊梅素>沒食子酸>綠原酸>咖啡酸>花旗松素>原兒茶酸>莽草酸>水楊酸>柚皮素。研究發現,MNP-NH2的吸附率與黃酮類和有機酸類化合物的鄰位酚羥基的存在和羥基個數有關,鄰位酚羥基越多被吸附的量越大。

2.4  MNP-NH2對金銀花中5種活性成分選擇性吸附研究

將制備的MNP-NH2納米材料作為吸附劑,研究MNP-NH2對金銀花中黃酮類成分木犀草苷、木犀草素、蘆丁及有機酸類成分綠原酸、咖啡酸的吸附性能。

2.4.1 色譜條件  色譜柱為Waters Symmetry C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動相為乙腈-0.2%磷酸水溶液,梯度洗脫:0~15 min,10%~20%乙腈;15~30 min,20%~55%乙腈;30~40 min,55%~10%乙腈;40~45 min,10%乙腈;檢測波長350 nm;體積流量1 mL/min;進樣量10 μL;溫度30 ℃。HPLC色譜圖見圖6。

2.4.2  混合對照品溶液的制備  取對照品綠原酸、咖啡酸、蘆丁、木犀草苷、木犀草素適量加甲醇定溶于10 mL量瓶中,即得。

2.4.3  金銀花樣品溶液的制備  取10 g金銀花,加30倍水,浸泡30 min,水浴提取1 h,提取2次,合并濾液并混勻,用0.45 μm微孔濾膜濾過,4 ℃冰箱保存,即得。

2.4.4  金銀花樣品溶液吸附  取5 mL金銀花樣品溶液,加入100mg氨基鐵,與5 mL未加氨基鐵母液,30 ℃超聲40 min,磁鐵分離后,離心13 000 r/min,10 min,進液相;剩余鐵加5 mL洗脫液,超聲40 min,進行洗脫,固液分離,取洗液過膜,按照“2.4.1”項下金銀花色譜條件進樣,得到吸附前、后的HPLC圖,計算出Q值。

2.4.5  方法學考察  精密度、重復性、穩定性試驗中金銀花中的5種成分綠原酸、咖啡酸、木犀草苷、木犀草素、蘆丁的保留時間RSD<2%、峰面積  RSD<3%,均符合要求,表明精密度、重復性良好,樣品在24 h內穩定。

2.4.6  吸附條件考察  取相同質量濃度的5種化合物溶液各5 mL,加入適量的MNP-NH2,恒溫超聲。分別用pH值為3、4、5、6、7、8磷酸鹽水溶液稀釋5種化合物儲備液,于25 ℃下的恒溫超聲40 min,考察pH值對MNP-NH2吸附性能的影響,結果見圖7-A。分別在0、15、30、45 ℃下,考察超聲溫度對MNP-NH2吸附性能的影響,結果見圖7-B。分別用0.0、0.5、1.0、1.5、2.0 mol/L的NaCl溶液稀釋5種化合物儲備液,于25 ℃下恒溫超聲40 min,考察離子濃度對MNP-NH2吸附性能的影響,結果見圖7-C。分別在0、5、10、15、20、25、30、40、50 min下,考察超聲時間對MNP-NH2吸附性能的影響,結果見圖7-D。

結果顯示,吸附時間在40 min時,基本都達到最大吸附平衡;離子濃度和溫度對吸附過程幾乎不影響。pH值在MNP-NH2對不同類化合物的吸附過程中影響較大,當pH值為3時,MNP-NH2對木犀草素與木犀草苷吸附最小,在pH值為5時,5種成分相對吸附量較高,在不同pH值下,5種化合物吸附存在一定差異。最終選擇30 ℃下超聲40 min作為最佳吸附條件。

2.4.7  洗脫條件考察  影響MNP-NH2洗脫效果的的主要因素有冰乙酸體積分數(A,10%、20%、30%)、甲醇體積分數(B,40%、60%、80%)、洗脫時間(C,15、30、45 min)和洗脫體積(D,3、5、7 mL)4個試驗因素。采用L9(34) 進行4因素3水平的正交試驗,收集洗脫液按“2.4.1”項下方法檢測溶液中中藥單體成分的質量濃度,計算洗脫率,并對結果進行方差分析。結果見表24。

由方差分析(表4)可知,對綠原酸的吸附率因素中無顯著性差異;對咖啡酸的吸附率因素中A和D有顯著性差異;對蘆丁的吸附率因素中B和D有顯著性差異;對木犀草苷的吸附率因素中A、B和D有顯著性差異;對木犀草素的吸附率因素中A、B和D有顯著性差異。

結合直觀分析(表3)和方差分析,最終確定最佳洗脫條件為加5 mL 20%冰乙酸液(甲醇-水60∶40)洗脫液,超聲40 min。

2.4.8  MNP-NH2循環利用性能  為考察MNP-NH2的循環利用性能,將其重新用于金銀花樣品液的吸附,重復進行8次。測得8次循環中MNP-NH2對金銀花樣品液的脫附率見圖8、9。MNP-NH2在吸附洗脫8次后,對金銀花中有效成分木犀草素、木犀草苷、蘆丁和咖啡酸保持較高的吸附率,達到50%以上;在循環洗脫過程中對蘆丁、木犀草苷和木犀草素保持較高的洗脫率,達到80%以上。綜上所述,MNP-NH2具有良好的循環再利用特點,這也為將來的實際應用提供堅實的基礎。

3  結論與討論

本實驗采用水熱法制備得到MNP-NH2磁性納米粒子,氨基成功修飾在磁性納米粒子表面,MNP- NH2復合粒子形貌規則、結構穩定、分布均勻且具有良好的磁性及循環再利用特點,可用于下一步吸附。MNP-NH2對金銀花提取液中黃酮類成分相對有機酸類成分吸附率要高,而且洗脫的過程中兩類化合物的差異較顯著,對金銀花中有效成分提取分離中具有潛在應用。

制備的MNP-NH2表面被修飾上豐富的氨基,與傳統分離純化方法,如大孔樹脂等相比,本方法最顯著的優點就是選擇性強,操作簡便能夠直接從金銀花提取液中分離出單體化合物,整個分離過程省時省力、操作簡單易控,通過外加磁場即可實現吸附載體與原料液的分離,是一種很好的分離純化方法。有望應用于中藥材等復雜成分體系中黃酮類及有機酸類化合物的提取分離系統中。

參考文獻(略) 

  源:曹雪曉,栗煥煥,邱喜龍,任曉亮,王  萌,裴高升. 氨基表面修飾磁性納米粒子(MNP-NH2)對黃酮類和有機酸類成分選擇吸附研究 [J]. 中草藥, 2018, 49(20):4816-4823.

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